| 問題 | 可能原因 | 驗(yàn)證或解決辦法 |
| 背景較高 |
封閉不充分 | 延長封閉時間，更換合適的封閉劑(脫脂奶粉，BSA,血清等) |
| 一抗?jié)舛冗^高 | 增加一抗稀釋倍數(shù)， | |
| 抗體孵育溫度過偏高 | 建議4℃孵育 | |
| 二抗非特異性結(jié)合 或與封閉劑交叉反應(yīng) |
設(shè)置二抗對照(不加一抗),降低二抗?jié)舛?/td> | |
| 一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng) | 在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應(yīng). | |
| 洗膜不充分 | 增加洗滌次數(shù) | |
| 膜不合適 | NC膜比PVDF膜背景低 | |
| 膜干燥 | 保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象 | |
| 沒有陽性條帶 或很弱 |
一抗、二抗等不匹配 |
訂購試劑時認(rèn)真選取一抗與組織種屬， 一抗與二抗或/和底物與酶 系統(tǒng)之間相匹配的抗體及底物。可通過設(shè)置內(nèi)參可以驗(yàn)證二級檢測 系統(tǒng)的有效性。 |
| -抗或/和二抗?jié)舛鹊?/td> | 增加抗體濃度，延長孵育時間 | |
| 封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng) | 封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的 脫脂奶、BSA、血清或明膠 | |
| 一抗不識別目的物種的靶蛋白 | 檢查說明書，或做ClustalW比對，設(shè)陽性對照 | |
| 樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過 低(抗原無效) | 設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標(biāo)本上樣量至少每孔 20-30ug蛋白，樣本制備時使用蛋白酶抑制劑，或分級提取目的蛋白。 | |
| 轉(zhuǎn)膜不充分，或洗膜過度 | 使用麗春紅S檢測轉(zhuǎn)膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉(zhuǎn)膜操作，勿 過度洗膜 | |
| 過度封閉 | 使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少 封閉時間 | |
| 一抗失效 | 使用有效期內(nèi)抗體，分裝保存，避免反復(fù)凍融取用，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用 | |
| 二抗受疊氮鈉抑制 | 所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑) | |
| 酶和底物失效 | 直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了、選擇在有 效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物，使用新鮮的底物. | |
| 曝光時間過短 | 延長曝光時間 | |
| 多非特異性條 帶 或條帶位置不 對 |
細(xì)胞傳代次數(shù)過多，使其蛋白表 達(dá)模式的分化 | 使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實(shí)驗(yàn) |
| 體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修 飾形式：乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等 | 查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小 |
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| 蛋白樣本降解 | 使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑 | |
| 新蛋白或同族蛋白的分享同種表 位的不同剪接方式 | 查其它文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，或BLAST搜尋，使用說明書報(bào)導(dǎo)的細(xì)胞株或組織 | |
| 一抗?jié)舛冗^高 | 降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶 | |
| 二抗?jié)舛冗^高產(chǎn)生非特異性結(jié)合 | 降低抗體濃度，增加二抗對照 選擇特異性更強(qiáng)，只針對重鏈的二抗 |
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| 抗體未純化 | 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶 | |
| 蛋白存在二聚體或多聚體 | SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min, |
| 以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性 | ||
| 背景有白色/黑 色斑點(diǎn) | 轉(zhuǎn)膜時有氣泡或抗體分布不均 | 盡量去除氣泡，抗體孵育時保持搖動 |
| 抗體與封閉劑結(jié)合 | 過濾封閉劑 | |
| 暗片現(xiàn)白條帶 | 一抗或二抗加入過多 | 稀釋抗體的濃度 |
| 目的條帶過低/ 過高 | SDS-PAGE膠濃度選擇不合適 | 調(diào)整膠濃度，分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃 度膠 |
| “微笑”條帶 | 遷移過快，電泳溫度過高 | 降低電泳速度，低溫電泳(冷室) |
| 轉(zhuǎn)膜不充分 |
膜沒有完全均勻濕透 | 使用100%methanol漫透膜 |
| 靶蛋白分子量小于10,000 | 選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間 | |
| 靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩 沖液pH值 | |可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液(pH10.5)或使用低pH值緩 沖液如乙酸緩沖液 | |
| 甲醇濃度過高 |
過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同 時會使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇 濃度或者使用乙醇或異丙醇代替 |
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| 轉(zhuǎn)移時間不夠Thick gel | 對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間 |
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